ایمونوفلورسانس (IFA) چیست؟

IFA چیست؟ ایمونوفلورسانس یا تکنیک IFA، یکی از تکنیک های متداول آزمایشگاهی است که بر پایه استفاده از آنتی بادی های خاص که از نظر شیمیایی به رنگ های فلورسنت متصل شده اند، می باشد. اساس ایمونوفلورسانس یا تکنیک IFA به این صورت است که آنتی بادی های نشاندار شده به طور مستقیم یا غیرمستقیم به آنتی ژن های قرار گرفته بر سطح سلول متصل می شوند. رنگ فلورسنتی که به آنتی بادی ها متصل است با قرار گیری در معرض امواج نوری با طول موج کوتاه و پرانرژی، نوری را با طول موج متفاوت منتشر می کند. این نور فلورسانس ساطع شده از آنتی بادی ها انرژی کمتری نسبت به نور جذب شده دارد، بنابراین طول موج نور ساطع شده بیشتر از نور محرک می باشد. برای مشاهده این رنگ های فلورسانس در تکنیک IFA می توان از میکروسکوپ های فلورسانس استفاده نمود. 


انواع تکنیک ایمونوفلورسانس

ایمونوفلورسانس، تکنیک IFA دارای دو نوع اصلی ایمونوفلورسانس مستقیم و غیر مستقیم است. اساس هر دو نوع تکنیک بر اتصال آنتی بادی به آنتی ژن بوده که در اینجا به معرفی آن ها می پردازیم:


1) ایمونوفلورسانس مستقیم (DIF)

این تکنیک یک روش رنگ‌ آمیزی بافت تک مرحله‌ ای است که امکان مشاهده یک آنتی ‌بادی نشان ‌دار شده با فلورسنت را در نمونه بیوپسی شده از بافت بدن فرد بیمار را فراهم می ‌کند که علیه آنتی ‌ژن مورد نظر هدایت شده است. در تکنیک ایمونوفلورسانس مستقیم به طور معمول از آنتی بادی های IgG، IgM، IgA و همچنین اجزای کمپلمان از جمله C3 و C4 استفاده می شود. در این روش آنتی بادی های نشان دار شده مستقیما به آنتی ژن های سطح سلولی (قسمت اپی توپ آنتی ژن) که هدف آن ها هستند متصل می شوند که امکان مشاهده آن را از طریق میکروسکپ های فلورسنت فراهم می کند. لازم به ذکر است که این نوع آزمایش IFA در آزمایشگاه برای تشخیص بیماری های پوست، کلیه و سایر اندام ها قابل استفاده می باشد. 

ایمونوفلورسانس مستقیم اگرچه به میزان کمتری رواج دارد، مزایای قابل توجهی نسبت به روش ثانویه یا غیر مستقیم دارد. یکی از این ویژگی های مثبت این روش این است که اتصال مستقیم آنتی بادی نشان دار به آنتی ژن باعث کاهش تعداد مراحل آماده سازی نمونه می شود، در نتیجه در زمان صرفه‌جویی شده و میزان سیگنال های پس ‌زمینه غیر اختصاصی کاهش می یابد. از دیگر مزایای ایمونوفلورسانس مستقیم این است که امکان واکنش متقابل آنتی بادی های نشان دار با یکدیگر (cross-reactivity) و اشتباهات احتمالی را در طول فرآیند محدود می کند. 

روش ایمونوفلورسانس مستقیم معایبی نیز دارد که یکی از آن ها محدود بودن تعداد مولکول های فلورسنتی است که می توانند به آنتی بادی اولیه متصل شوند. این امر باعث می شود که حساسیت این روش به طور قابل ملاحظه ای کمتر از روش غیر مستقیم باشد. از دیگر نکات منفی در تکنیک IFA مستقیم می توان به هزینه بالای آن اشاره کرد که به دلیل نیاز به آنتی بادی های بیشتر می باشد. 


2) ایمونوفلورسانس غیرمستقیم 

در این روش ایمونوفلورسانس از دو نوع آنتی بادی اولیه (غیر نشان دار) و ثانویه (نشان دار) استفاده می شود. آنتی بادی اولیه، آنتی بادی است که فاقد فلوروفور بوده و به طور مستقیم به آنتی ژن هدف متصل می گردد. پس از اتصال این آنتی بادی به آنتی ژن، آنتی بادی ثانویه که نشاندار است و توانایی اتصال به آنتی بادی اول را دارد به محیط واکنش اضافه می شود. در این روش آنتی بادی های ثانویه متعددی می توانند به یک آنتی بادی اولیه متصل شوند بنابراین این امر با افزایش تعداد مولکول های فلوروفور متصل به هر آنتی ژن، سیگنال را تقویت می کند. 

پروتکل روش غیرمستقیم پیچیده‌تر و زمان‌برتر از پروتکل ایمونوفلورسانس مستقیم است، اما انعطاف‌پذیری بیشتری دارد چون انواع آنتی ‌بادی ‌های ثانویه مختلف و تکنیک ‌های تشخیصی را می ‌توان برای یک آنتی ‌بادی اولیه خاص استفاده کرد. روش غیرمستقیم، یکی از تکنیک های کاربردی در تشخیص بیماری های خود ایمنی می باشد و از سرم بیمار به عنوان نمونه مورد آزمایش استفاده می شود.

انواع بیماری های خود ایمنی که توسط تکنیک ایمونوفلورسانس غیرمستقیم تشخیص داده می شوند عبارتند از:

Pemphigus vulgaris؛

Pemphigus foliaceus ؛

Paraneoplastic pemphigus ؛

Immunoglobulin (Ig)A pemphigus ؛

Linear IgA bullous dermatosis and chronic bullous disease of childhood ؛

Dermatitis herpetiformis ؛

Bullous pemphigoid ؛

Pemphigoid gestationis ؛

Mucous membrane pemphigoid ؛

Epidermolysis bullosa acquisita ؛

Bullous systemic lupus erythematosus.

نویسنده و مترجم : پریسا جاوید زاده

منابع : Svarlifescience Abcam dermnetnz