تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) چیست؟

معرفی ایمونوهیستوشیمی: تست ایمونوهیستوشیمی (IHC) در بافت شناسی و برای تشخیص وجود نشانگر پروتئینی خاص استفاده می شود که می تواند به طبقه بندی و تشخیص دقیق تومور کمک کند. به طور کلی، ایمونوهیستوشیمی یک تکنیک رنگ آمیزی است که در کنار رنگ آمیزی های روتین بافت شناسی (مانند تکنیک هماتوکسیلین و ائوزین) و برای تکمیل یافته های حاصل از این رنگ آمیزی ها مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین، در مواردی که نمی توان براساس رنگ آمیزی های معمولی نتیجه گیری قطعی در خصوص ماهیت یک بافت داشت، تست ایمونوهیستوشیمی به کمک تشخیص آزمایشگاهی می آید. 


روش انجام IHC

همانطور که گفته شد، کاربرد ایمونوهیستوشیمی، تعیین آنتی ژن های خاص در یک نمونه بافتی است. آنتی ژن ها پروتئین هایی هستند که در داخل یا روی سطح سلول قرار دارند. وجود یا عدم وجود آنتی ژن های سلولی خاص به آسیب شناسان برای تشخیص ماهیت بافت و افتراق نمونه های سالم از سرطانی کمک می کند. صدها آنتی ژن وجود دارد که از نظر تشخیصی مفید هستند. اغلب، یک پاتولوژیست از پانلی حاوی چندین آنتی ژن برای کمک به طبقه بندی کامل یک تومور خاص استفاده می کند.

پیش از آغاز تست ایمونوهیستوشیمی لازم است که یک برش بافتی از نمونه مورد نظر تهیه شود. این برش از روی بافت فیکس شده در داخل پارافین (در اصطلاح بلوک بافتی) تهیه شده و سپس بر روی یک اسلاید شیشه ای (در اصطلاح لام) تثبیت می شود. این برش بافتی تثبیت شده بر روی لام در تمامی مراحل بعدی ایمونوهیستوشیمی مورد استفاده قرار می گیرد. 

اولین مرحله برای انجام IHC، استفاده از یک آنتی بادی اولیه است که به طور خاص به آنتی ژن هدف متصل می شود. دو نوع اصلی آنتی بادی وجود دارد، پلی کلونال و مونوکلونال. آنتی بادی های پلی کلونال ممکن است با انواع مختلفی از آنتی ژن هدف، اتصال پیدا کنند و به همین دلیل احتمال مشاهده خطا و اشتباه در تعیین آنتی های غیر هدف به جای آنتی ژن های هدف بیشتر است. آنتی بادی های مونوکلونال تنها به یک اپی توپ خاص متصل می شوند و رنگ آمیزی حاصل تمیزتر و اختصاصی تر می شود اما حساسیت یا شدت رنگ کمتری دارد.

پس از اتصال آنتی بادی اولیه به آنتی ژن، در مرحله بعد، آنتی بادی های ثانویه به آنتی بادی اولیه متصل می شوند. در حال حاضر این روش به صورت روتین برای انجام IHC استفاده می شود زیرا چندین آنتی بادی ثانویه می توانند به یک آنتی بادی اولیه متصل شده و شدت رنگ را تقویت کنند.

یک رنگ تشخیصی بر روی آنتی بادی ثانویه سوار شده است. این ترکیبات معمولا آنزیم هایی مانند پراکسیداز ترب کوهی (HRP) هستند که به یک آنتی بادی ثانویه متصل شده اند. این آنزیم ها می توانند مولکول های خاصی به نام سوبسترا (که در اصطلاح کروموژن نامیده می شود) را شکسته و رنگی ایجاد کنند که در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده است. مجموع این ترکیبات در کنار هم به آسیب شناس اجازه می دهند که در تعیین آنتی ژن و شناسایی ماهیت بافتی موفق عمل کند.

همچنین، رنگ زمینه آبی که اغلب بعد از استفاده می شود، زمینه لام را به رنگ های مخالف کروموژن تغییر میدهد تا امکان مشاهده بهتر آنتی ژن ها در زمینه لام فراهم آید. 



بهبود روش تعیین و تشخیص آنتی ژن خاص در بدن

اگرچه کاربرد ایمونوهیستوشیمی در تشخیص های آزمایشگاهی بسیار وسیع بوده و این روش بسیار دقیق و ارزشمند است، آماده سازی نمونه های بافتی برای بررسی بافت شناسی نیاز به مراقبت، مهارت و انجام روش ها به صورت صحیح دارد. در اینجا روش هایی را برای جلوگیری از بروز اشتباهات رایج و همچنین دستیابی به بهترین کیفیت از تست ایمونوهیستوشیمی معرفی کرده ایم که میتواند در آزمایشگاه های تشخیص طبی به کار گرفته شود. به طور کلی، هدف از این بخش این است که کاربرد ایمونوهیستوشیمی در تشخیص آنتی ژن ها و ماهیت بافتی با دقت و صحت بالاتری انجام شود و در صورت بروز مشکل، این امکان وجود داشته باشد که مشخص شود که علت کیفیت ضعیف مشاهده شده در نتایج IHC چیست.

مرحله 1 - از برش های بافتی با کیفیت بالا استفاده کنید: برای انجام ایمونوهیستوشیمی بهتر است که از برش های بافتی با کیفیت بالا به همراه لام های شارژ شده یا دارای پوشش APES استفاده کنید. قرارگیری نامناسب بافت بر روی لام میتواند منجر به ایجاد مقاطع ناهموار و دارای چسبندگی ضعیف، با رنگ‌آمیزی پس‌زمینه نامناسب و تجمع آنتی بادی ها به صورت لکه ای و غیر قابل تشخیص شود؛

مرحله 2 – از تثبیت بافتی مناسب اطمینان حاصل کنید: تثبیت مناسب بافت بر روی لام، با کیفیت خوب و با استفاده از شرایط تثبیت خاص (نوع تثبیت کننده، pH، دما، زمان) بهترین نتایج را ایجاد می کند. نمونه ها باید قبل از انجام تست بررسی شوند تا مشخص شود که آیا نیاز به تثبیت بیشتر یا کمتر هست یا خیر؛

مرحله 3 – از ترکیبات چسبندگی برش بافتی بر روی لام استفاده نکنید: از چسب های مورد استفاده جهت اتصال برش پروتئینی در حمام فلوتاسیون (چسب، نشاسته یا ژلاتین) استفاده نکنید. چسب های مبتنی بر پروتئین می توانند سطح اسلاید را مسدود کنند. این امر باعث چسبندگی غیرمتعادل می شود و به دلیل تجمع معرف های IHC در زیر بخش های چسبیده نشده، لکه های رنگی نامناسب تشکیل می شود؛

مرحله 4 – غلظت محلول ها را تنظیم کنید: گاهی اوقات شاهد وجود لکه رنگی قوی در یک انتهای لام هستیم که در انتهای دیگر به رنگ‌آمیزی ضعیف تبدیل می‌شود. چنین مشکلاتی با استفاده از علظت های مناسب و همگن محلول ها قابل حل است؛

مرحله 5 - آنتی بادی را با دقت انتخاب کنید: آنتی بادی اولیه خود را با توجه به حساسیت و ویژگی آن با دقت انتخاب کنید. توجه داشته باشید که آنتی‌بادی‌هایی که توسط تامین‌کنندگان مختلف فروخته می‌شوند، اغلب از یک منبع می‌آیند و برای فروش مجدد بسته‌بندی/برند می‌شوند. بنابراین، استفاده از نام کلون هنگام ارزیابی آنتی بادی مهم است. برای تعیین مناسب بودن روش خود برای یک آنتی بادی خاص، همیشه برگه مشخصات را بررسی کنید. هنگامی که نوع جدیدی از آنتی بادی خریداری می شود، برگه های مشخصات باید براساس محصول جدید به روز رسانی شوند؛

مرحله 6 – مراحل انجام آزمایش را بر اساس ترکیبات مورد استفاده خود تنظیم کنید: مراحل کار را براساس نوع آنتی بادی اولیه و ثانویه مورد استفاده، نوع رنگ آمیزی بافتی و شرایط تثبیت بافت بکار گرفته شده انتخاب کنید (pH، معرف، شرایط واکنش) و از احتمال بروز واکنش بین آنتی بادی ها و محصولات غیرهدف موجود در نمونه و همچنین راه های به حداقل رساندن این واکنش ها آگاه باشید (برگه مشخصات هر آنتی بادی را با دقت بخوانید)؛

مرحله 7 – مراقب شدت رنگ زمینه باشید: گاهی اوقات به دلیل شدت رنگ پس زمینه، این رنگ به رنگ های تشخیصی آنتی بادی ها غلبه می کند. بنابراین، تنظیم این رنگ یکی از مهمترین مراحل در داشتن یک لام با کیفیت IHC است. همچنین، از یک رنگ تشخیصی مناسب استفاده کنید که رنگ‌آمیزی دقیق و خاص با حساسیت کافی ارائه دهد؛

مرحله 8 - مراحل شست و شو را استاندارد کنید: از مراحل شستشوی استاندارد در تمام طول مدت کار (مدت، حجم و شکل هم زدن) استفاده کنید. این امر ثبات نتایج را تضمین می کند. مشاهده شده است که حتی در یک آزمایشگاه، نتایج در دو نوبت با آنتی بادی یکسان و بین اجراها در روزهای مختلف بسیار متغیر است. این می تواند به دلیل روش های مختلف شستشو باشد که توسط اپراتورهای مختلف استفاده می شود؛

مرحله 9 - از کنترل های مناسب استفاده کنید: همیشه از کنترل های مثبت و منفی مناسب استفاده کنید تا نتایج را تایید کنند. کنترل های داخلی مثبت و منفی نیز مهم هستند و ابزار عالی برای اطمینان از تضمین کیفیت در IHC هستند. 


یک مرحله ساده، اما گاهی نادیده گرفته شده، انتخاب آنتی بادی هایی است که برای ایمونوهیستوشیمی استفاده می شوند. این انتخاب می تواند جلوی بروز بسیاری از مشکلات را بگیرد. برخی نکات وجود دارد که باید در مورد آنتی بادی ها در نظر داشت. اول اینکه آنتی بادی که ممکن است در یک آزمایشگاه به خوبی کار کند ممکن است برای آزمایشگاه شما مطلوب نباشد. بنابراین، هر آنتی بادی باید با سیستم رنگ آمیزی شما آزمایش شود. علاوه براین، آنتی بادی ها به مرور زمان می توانند شدت رنگ خود را از دست بدهند. قرار گرفتن در معرض هوا و نور می تواند باعث این امر شود.

هنگام انتخاب آنتی بادی ها، دو گزینه اصلی وجود دارد که می توانید آن را انتخاب کنید: 

1) فرمت فشرده؛

2) فرمت آماده برای استفاده از پیش رقیق شده (RTU).

آنتی بادی های فشرده اغلب انعطاف پذیر هستند، قیمت اولیه خرید پایین تری دارند و به طور کلی می توانند در هر سیستم رنگ آمیزی، چه به صورت خودکار و چه دستی، با توجه به توصیه های سازنده استفاده شوند. با این حال، انواع فشرده به زمان آماده سازی و اعتبارسنجی نیاز دارند.  انواع RTU را می توان با توجه به هزینه موجود، زمان رنگ آمیزی و کیفیت سایر مواد بهینه سازی کرد. از آنجایی که هیچ راه قطعی برای تعیین خواص و پایداری یک آنتی بادی رقیق شده بدون مطالعات کنترل شده وجود ندارد، کیفیت رنگ‌آمیزی ممکن است به خطر بیفتد. از مزایای RTU ها می توان به افزایش راندمان آزمایشگاهی، کنترل کیفیت بهتر و مدیریت راحت تر معرف اشاره کرد. آن ها زمان صرف شده برای رقیق سازی کار، آماده سازی و زمان اعتبارسنجی سنجش را به خصوص در سیستم های خودکار حذف می کنند. 

بنابراین، انتخاب روش انجام کار بیش از هر چیز به استفاده ای که ما می خواهیم از تست داشته باشیم و نوع ترکیبات مورد استفاده بستگی دارد. 

نویسنده و مترجم : فرزانه رامی

منابع : leicabiosystems